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Jerome Genth

Bachelorarbeit fertig - was nun?

Laborarbeit will gelernt sein. Doch wo und wie lernt man sie am besten? By doing. Zumindest ging mir das während meiner Bachelorarbeit so. Mein Ziel war es nämlich, während dieser Zeit mein Methoden-Spektrum ordentlich zu erweitern. Inzwischen kann ich sagen: Ziel erreicht. Die Arbeit liegt hinter mir. Und ich freue mich darauf, das Gelernte nun für meinen Master parat zu haben.

Durch die Vorlesung Radiochemie und das Pflanzenbiochemie Praktikum im 5 ten Semester lernte ich Dr. Thomas Vogt kennen. Seine Arbeitsgruppe am IPB (Leibniz Institut für Pflanzenbiochemie) beschäftigt sich mit der Biosynthese und Funktion pollenspezifischer Phenolamide und Flavonolglycoside. Nach ein paar Interessanten Gesprächen mit Dr. Vogt entschied ich mich dafür meine Bachelorarbeit am IPB zu machen.

Die Aufgabe meiner Bachelorarbeit war es eine effiziente Expressions- und Reinigungsstrategie zur Produktion von hochreinem Enzym zu entwickeln. Bei dem Enzym handelt es sich um eine Glykosyltransferase, genauer einer spezifischen Flavonoid-Zucker-Zuckertransferase. Die Reaktion dieses Enzyms habe ich euch in Abbildung 1 einmal veranschaulicht.

Abbildung 1 Reaktion der Glycosyltransferase

Jetzt fragt ihr euch bestimmt: „Wieso ich mich mit diesem Enzym beschäftigt habe?“ Ganz Einfach, bisher ist die Struktur sowie der genaue Reaktionsmechanismus dieser Enzymklasse unbekannt. Dies hängt mit der Schwierigkeit der Expression zusammen, gerade die inclusion bodies Bildung ist ein sehr großes Problem bei dem Umgang mit diesen Enzymen.

Wie bin ich also vorgegangen?
Ich habe verschiedene mikrobielle Systeme getestet, dazu gehörten E.coli Derivate wie Rosetta, BL21 und Lemo21. Des Weiteren habe ich Strategien zur Verbesserung der löslichen Proteinausbeute angewendet. Ich habe das Codon Usage angepasst und die Wachstumstemperaturen optimiert. Meine Ergebnisse habe ich mittels der Enzymaktivität überprüft, es galt je mehr Aktivität desto besser! So kam es auch mal vor das ich bis um 21 Uhr zusammen Kerstin Manke, der Technische Mitarbeiterin, im Labor stand.

Mitthilfe dieser Strategien war es mir möglich die Ausbeuten an löslichen Protein soweit zu steigern, dass ich ein schon relativ zeitnah ein up scaling vornehmen konnte – von 3 mL auf 1 Liter Bakterienansatz. Doch die arbeitsaufwendige Angelegenheit hat sich gelohnt! Es war erstmals möglich die Glykosyltransferase auf einer SDS-PAGE zu sehen! Ein großer Erfolg! Es wurde soviel reines Protein erhalten, das das Enzym erstmals Protein- und biochemisch Charakterisiert werden konnte.

Also Fing ich an kinetische Parameter aufzunehmen. Da es sich bei einer Glykolysierungsreaktion um eine Zwei-Substrat-Kondensationsreaktion (siehe Abbildung 1) handelt, habe ich zur Bestimmung der kinetischen Parameter die Substratkonzentrationen beider Partner gegenüber einem Überschuss des Zweitsubstrates variiert.

Klingt komplizierter als es eigentlich ist!
Und somit waren auch schon knapp 3 Monate vergangen, es endete eine unvergessliche Zeit am IPB. Abschließend lässt sich sagen, das ich während dieser Zeit eine Menge lernen konnte. Bei Fragen fand ich immer ein offenes Ohr bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, ein besonderer Dank gilt hierbei Dr. Thomas Vogt und Kerstin Manke. Ich fühlte mich während meiner doch kurzen Zeit im Labor herzlich aufgenommen, soviel es mir auch schwer das IPB wieder zu verlassen.

Ich kann allen das IPB als Praktikums-, Bachelor- oder Masterplatz nur ans Herz legen. Ich selber werde zwei Mastermodule (Zellbiochemie und Pflanzenbiochemie) am IPB belegen! dazu lest ihr im nächsten Blog mehr.

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